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測序知識小科普:常用測序方式簡介

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點擊次數:2169 更新時間:2019年06月06日15:08:54 打印此頁 關閉

.什麽是高通量測序?

高通量測序技術(High-throughput sequencing,HTS)是對傳統 Sanger 測序(稱為一代測序技術)革命性的改變,一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing,NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。

.什麽是 Sanger 法測序(一代測序)?

Sanger 法測序利用一種 DNA 聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成,每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP),並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基團,使延長的寡聚核苷酸選擇性地在 G、A、T C 處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種 dNTPs ddNTPs 的相對濃度可以調整,使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點,但終止在不同的的核苷酸上,可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段,凝膠處理後可用 X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

.什麽是基因組重測序(Genome Re-sequencing)?

全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序,並在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低,人類疾病的致病突變研究由外顯子區域擴大到全基因組範圍。通過構建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結合的策略進行高通量測序,實現在全基因組水平上檢測疾病關聯的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點,以及結構變異等,具有重大的科研和產業價值。

.什麽是 de novo 測序?

de novo 測序也稱為從頭測序:其不需要任何現有的序列資料就可以對某個物種進行測序,利用生物信息學分析手段對序列進行拚接,組裝,從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術的飛速發展,基因組測序所需的成本和時間較傳統技術都大大降低,大規模基因組測序漸入佳境,基因組學研究也迎來新的發展契機和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術以及強大的生物信息分析能力,可以高效、低成本地測定並分析所有生物的基因組序列。

.什麽是外顯子測序(whole exon sequencing)?

外顯子組測序是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域 DNA 捕捉並富集後進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對於基因組重測序成本較低,對研究已知基因的 SNP、Indel 等具有較大的優勢,但無法研究基因組結構變異如染色體斷裂重組等。

.什麽是 mRNA 測序 (RNA-seq)?

轉錄組學(transcriptomics)是在基因組學後新興的一門學科,即研究特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有 RNA(包括 mRNA 和非編碼 RNA)的類型與拷貝數。Illumina 提供的 mRNA 測序技術可在整個 mRNA 領域進行各種相關研究和新的發現。mRNA 測序不對引物或探針進行設計,可自由提供關於轉錄的客觀和權威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的 poly-A 尾的 RNA 完整序列信息,並分析基因表達、cSNP、全新的轉錄、全新異構體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉錄等最全麵的轉錄組信息。簡單的樣品製備和數據分析軟件支持在所有物種中的 mRNA 測序研究。

.什麽是 small RNA 測序?

Small RNAmicro RNAs、siRNAs pi RNAs)是生命活動重要的調控因子,在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina 能夠對細胞或者組織中的全部 Small RNA 進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將 18-30 nt 範圍的Small RNA 從總 RNA 中分離出來,兩端分別加上特定接頭後體外反轉錄做成 cDNA 再做進一步處理後,利用測序儀對 DNA 片段進行單向末端直接測序。通過 Illumina Small RNA 大規模測序分析,可以從中獲得物種全基因組水平的 miRNA 圖譜,實現包括新miRNA 分子的挖掘,其作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs 聚類和表達譜分析等科學應用。

.什麽是 miRNA 測序?

成熟的 microRNAmiRNA)是 17~24nt 的單鏈非編碼 RNA 分子,通過與 mRNA 相互作用影響目標 mRNA 的穩定性及翻譯,最終誘導基因沉默,調控著基因表達、細胞生長、發育等生物學過程。基於第二代測序技術的 microRNA 測序,可以一次性獲得數百萬條 microRNA序列,能夠快速鑒定出不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的 microRNA及其表達差異,為研究 microRNA 對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。

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